XVI edição do “Prêmio de Incentivo em Ciência, Tecnologia e Inovação para o SUS”

XVI edição do “Prêmio de Incentivo em Ciência, Tecnologia e Inovação  para o SUS”

A Profa. Dra. Ester C. Sabino, Diretora do Instituto de Medicina Tropical e colaboradores, Carla Luana Dinardo, Juliana Vieira Bianchi Ingrid H. Ribeiro, Márcia Regina Dezan, Valéria Brito Oliveira, Francisco C. A. Gomes, José E. Krieger, Alexandre Costa Pereira, Hadassa Campos Santos, Helves Domingues, Vanderson Geraldo Rocha e Alfredo Mendrone-Júnior, das instituições parceiras: Fundação Pró-Sangue Hemocentro de São Paulo e Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular, concorreram ao prêmio da XVI edição do “Prêmio de Incentivo em Ciência, Tecnologia e Inovação  para o SUS” (Programa Pesquisa para o SUS – PPSUS), ficando na 3ª colocação com o trabalho: “Padronização de estratégia molecular custo-efetiva para rastreamento de fenótipos eritrocitários e plaquetários raros em doadores de sangue visando à organização de banco de doadores
raros no Estado de São Paulo”

 

Introdução

Pacientes em regime crônico de transfusão, principalmente falcêmicos, tem uma elevada taxa de aloimunização eritrocitária, que está associada a reações hemolíticas tranfusionais1. Quando há formação de múltiplos alo-anticorpos ou de alo-anticorpos contra antígenos de alta frequência populacional, somente doadores raros pode atender os pacientes. A busca por estes doadores pode ser feita por técnicas sorológicas ou moleculares, ambas economicamente desvantajosas. Nesta esfera, a técnica de genotipagem através de microarranjos líquidos em equipamento de OpenArray® representa uma estratégia promissora para ser aplicada em hemocentros, pelo baixo custo da reação2. Não há, em São Paulo, nenhum hemocentro público realizando a triagem molecular para a identificação de doadores raros, sendo o suprimento de unidades raras feito eventualmente por entidades privadas ou por outros estados/países.

 

 

Objetivos

1- Padronizar a genotipagem em larga escala para determinação de antígenos eritrocitários e plaquetários pela técnica de microarranjos líquidos em equipamento OpenArray® em doadores de sangue, de forma a torná-la estratégia viável para a identificação de doadores raros para atendimento do estado de São Paulo. 2- Elaboração de software para registro destes doadores, com interface com o equipamento de genotipagem.

Resultados

5487 doadores foram genotipados usando a estratégia descrita, consumindo uma quantidade total de 59 placas de hibridização. Das 28 variações genéticas avaliadas, vinte e seis foram adequadamente genotipadas, gerando resultados acuradamente agrupados, e duas (K/k e U+w) falharam, devido à grande quantidade de resultados não amplificados e inválidos.

372 doadores foram genotipados por lote, consumindo tempo total de 11h30 min incluindo todas as etapas desde a extração de DNA à disponibilização dos dados para o software de gerenciamento dos dados. As amostras de todos os doadores foram genotipadas em 15 dias de trabalho.

Os resultados foram interpretados por ensaio (SNP ou variação genética incluído na placa), levando em consideração a fluorescência de VIC e FAM, e clusterizados (agrupados) pelo sistema de análise. 142.662 SNPs foram genotipados e 81,4% dos resultados foram considerados válidos, ou seja, foram automaticamente agrupados pelo software do fabricante e pertenciam a uma placa de matriz cujos controles internos foram acuradamente genotipados. Os resultados com falha ​​totalizaram 18.6% e foram devidos a não amplificação das sequências de DNA  (fluorescência VIC e FAM abaixo do pré-estabelecido limiar) (11,36%), resultados indeterminados (não agrupados pelo software do fabricante) (6,26%) e resultados inválidos (baixo sinal de fluorescência em VIC ou FAM (0,98%).

A quantidade total de discrepâncias envolvendo amostras-controle anteriormente genotipadas foi de 0,39% (12 resultados discrepantes em um total de 3.044 SNPs de amostras de controle genotipados com resultados válidos). A precisão geral do ensaio foi superior a 99,6%, e a reprodutibilidade foi de 99,74%.

Os dados resultantes foram conectados ao software de criação própria que permitiu a busca de doadores com base no fenótipo desejado, facilitando a identificação de unidades compatíveis. Somente os resultados válidos estavam disponíveis para o usuário do software (Figura2).

Foram identificados 70 doadores com fenótipos muito raros, a saber: 32 doadores VS+; 2 doadores mutação C/c intron 2; 3 doadores k-; 7 doadores Jsb-; 5 doadores Lub-; 2 doadores S silencioso; 1 doador Dib-; 1 doador Joa-; 2 doadores Coa-; 9 doadores Yta– e 6 doadores Kna-.

É importante ressaltar que, no Brasil, só existe registro de um doador ativo com fenótipo Dib-, registrado em banco de sangue privado. No Hospital das Clínicas da FMUSP existem dois pacientes com anti-Lu3 e um com anti-Kpb que foram transfundidos com bolsas dos doadores identificados no presente estudo. Até o momento, a transfusão tinha sido postergada para estes três casos.

Conclusão

A genotipagem através de microarranjos líquidos (OpenArray®) proposta neste estudo mostrou ser ferramenta efetiva para rastreamento de doadores de sangue com fenótipos raros. A automação de todas as etapas experimentais e o interfaceamento completo dos dados minimizaram os erros humanos e aumentaram a rapidez do processo descrito, que pode ser aplicado como estratégia de genotipagem de doadores de todo o Estado de São Paulo.